CHO細胞與293細胞高效快速表達制備克級別蛋白

20世紀80年代初亿卤，基因重組技術開始應用于動物細胞幔亥，1984年Genentech公司首次實現(xiàn)重組CHO細胞表達組織型纖溶酶原激活劑（tissue type Plasminogen Activator电谣，t-PA），標志著哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的建立美澳。隨后竞阐，許多外源蛋白基因相繼被轉染到哺乳動物細胞，一些有價值的蛋白不斷實現(xiàn)表達硫椰，包括凝血因子繁调、促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）靶草、免疫球蛋白蹄胰、尿激酶（Urokinase，UK）奕翔、乙肝表面抗原（HBsAg）和單克隆抗體等裕寨。近幾年，平均每年15種以上重組蛋白新藥通過美國食品和藥物管理局（FDA）批準派继，而且?guī)讉€重磅性的生物抗體藥專利快到期促使生物仿制藥的出現(xiàn)宾袜，全球生物抗體藥銷售額超過1200億美元/年

抗體藥物生產的宿主細胞主要NS0、HEK293驾窟、Hybridoma庆猫、 SP2/0、CHO等绅络，但CHO細胞是生產抗體藥物應用最廣的宿主細胞月培，主要有以下原因：（1）CHO細胞能夠較好的適應懸浮培養(yǎng)，在生物反應器中獲得較高的密度昨稼，有利于在工業(yè)上大規(guī)模培養(yǎng)节视；（2）CHO細胞不易傳播人類的病毒^[8]；（3）CHO細胞能夠在無血清和化學成分明確的培養(yǎng)基培養(yǎng)假栓，它能夠確保不同批次培養(yǎng)的重現(xiàn)性寻行；（4）CHO細胞能夠在翻譯后進行修飾^[9]（尤其是在糖蛋白方面進行糖基化），并且其糖型與人類基本一致匾荆；（5）DHFR和GS等擴增基因能夠在CHO細胞實現(xiàn)拌蜘，并最終實現(xiàn)較高表達目的蛋白。CHO細胞類型也比較多牙丽，例如：DG44简卧、DXB11、CHO K1烤芦、CHO-S等举娩。上世紀八九十年代開始，工業(yè)上使用較早的是DHFR體系（二氫葉酸還原酶缺陷型）DG44細胞。當細胞培養(yǎng)基內還有MTX（甲氨蝶呤）時铜涉，二氫葉酸還原酶被抑制智玻，通過反饋調節(jié)，使得該基因自我擴增芙代，連帶齊上下100-1000kb的基因都會擴增吊奢，如此目的基因也得到擴增，即可以提高目的蛋白的表達量∥婆耄現(xiàn)在很多單抗生產的體系依然是DG44页滚。GS體系（谷氨酰胺合成酶）CHO-K1是近些年發(fā)展的一種基因擴增篩選系統(tǒng)，較DHFR系統(tǒng)有明顯的優(yōu)越性铺呵，目前在國際上得到了廣泛地認可裹驰。其原理是GS在ATP水解提供能量的同時，利用細胞內的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺片挂。在缺乏外源的谷氨酰胺培養(yǎng)基中加入GS抑制劑甲硫氨酸亞砜亞銨（MSX）邦马，可使GS基因及與之相連的目的基因得到有效擴增，從而達到提高目的基因表達水平的目的宴卖。該系統(tǒng)的優(yōu)點主要在^[16]：該系統(tǒng)不需要基因缺陷型的CHO-K1細胞株做為宿主細胞；CHO-K1細胞易于培養(yǎng)邻悬，更強壯症昏；在培養(yǎng)基中無需加谷氨酰胺，能夠避免谷氨酰胺分解造成培養(yǎng)體系中氨水平高的問題父丰，降低了工藝控制的難度肝谭，并且可有效提高細胞發(fā)酵密度和延長細胞生存時間。

適合于CHO細胞表達的Vector的基本元素包括：啟動子（Promoter）蛾扇、poly A signal攘烛、篩選標記（Selectable marker）、克隆位點（Cloning site）復制起始位點（Origin of replication)镀首，有些有報告基因（Reporter gene）坟漱。啟動子一般用的較多的是SV40和CMV兩種，而CMV啟動子一般會在目的基因（輕鏈和重鏈）的前面更哄，而SV40一般會在篩選標記的前面芋齿。篩選標記一般有兩種：代謝型和抗生素類型（或者稱擴增型基因篩選標記和非擴增型基因篩選標記）。常見的篩選標記見表1成翩，工業(yè)界用的較多篩選標記為DHFR觅捆、GS、G418和puromycin等麻敌。

表一-哺乳動物細胞表達載體中常用的篩選標記

轉染類型一般有穩(wěn)定轉染和瞬時轉染兩種栅炒。在單抗細胞株篩選穩(wěn)轉前通常通過瞬時轉染得到一些抗體，進行質量分析，初步判斷是否滿足我們所需要的抗體赢赊；或者進行一些前期的啟動子乙漓、密碼子等組件的優(yōu)化。穩(wěn)定轉染是外源DNA既可以整合到宿主染色體中域携，也可能作為一種游離體存在簇秒。在CHO或293細胞中進行穩(wěn)定轉染時，外源DNA是整合到CHO染色體中秀鞭，不會存在游離態(tài)趋观，因為一般質粒中復制起始位點針對原核生物，在真核生物沒有作用锋边，所以在篩選過程中皱坛，游離態(tài)的DNA會隨著傳代無法復制而丟失。

常用于哺乳動物細胞轉染方法：磷酸鈣法豆巨、陽離子脂質體法剩辟、陽離子聚合物法和電穿孔法，在工業(yè)界使用最多的應該是陽離子脂質體法和電穿孔法往扔。瞬時電轉可以做到1.0 g/L以上（大體積）贩猎，可以快速制備克級別蛋白抗體。

圖一-CHO細胞大體積電轉與脂質體轉染對比

 如需要制備10克或以上蛋白抗體萍膛，CHO細胞轉染之后吭服，通常會做一個pool或minipool，然后進行篩選蝗罗。結合筆者經驗艇棕，主要簡單介紹Puromycin、G418串塑、MTX以及MSX等篩選壓力原理及濃度范圍沼琉。Puromycin為氨基糖甙類抗生素，通過干擾核糖體功能阻斷哺乳動物細胞的蛋白質合成桩匪，來自鏈霉菌的pac基因具有解除puromycin毒性的作用打瘪。在篩選的時候，puromycin濃度一般在10ug/ml-50ug/ml吸祟。G418是一種氨基糖苷類抗生素瑟慈，是穩(wěn)定轉染最常用的抗性篩選試劑之一。G418在篩選的時候一般濃度范圍為：200ug/ml-700ug/ml屋匕。MTX為葉酸拮抗劑葛碧，在細胞內經過轉換后可抑制 DHFR的活性，抑制核酸合成过吻，引起細胞毒性进泼。文獻報道稱^[13]蔗衡，隨著MTX濃度的增加，絕大多數(shù)細胞死亡乳绕，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中绞惦，DHFR基因得以擴增，目的基因拷貝數(shù)隨著增加洋措，提高表達量济蝉。MTX篩選時候，一般濃度范圍：25nM-1000nM菠发。MSX篩選用的是谷氨酰胺合成酶基因GS系統(tǒng)壓力王滤。谷氨酰胺合成酶（GS）擴增系統(tǒng)是新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)，具有更高的擴增效應滓鸠。MSX篩選時候雁乡，一般濃度范圍：25uM-500uM。

圖二-CHO細胞穩(wěn)轉minipool的表達量情況

 綜上糜俗，對于早研或成藥性評價過程中踱稍，需要快速制備大量蛋白抗體，有兩種較為合適的方法：1）瞬時電轉可以做到1.0 g/L以上（大體積）悠抹，可以快速制備克級別蛋白抗體珠月，周期2-3周；2）CHO細胞穩(wěn)轉之后楔敌，通常會做一個pool或minipool桥温，然后進行篩選高表達minipool，周期在6周左右梁丘。

• 24小時抗體人源化與工程改造一步到位；

• 3周快速表達制備克級別蛋白抗體旺韭；

• 極致的性價比氛谜，超預期的客戶體驗；

引用文獻資料：

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